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在神经精神疾病的基础研究中，对模型动物以及药物影响下大脑功能准确的定量观察是极为重要的，这种活体脑功能的观察能够帮助我们理解药物影响大脑的机制，并且帮助我们寻找新的biomarker，并进一步开展新药的筛选。功能性核磁共振（fMRI）可以提供大脑活动和功能连接的信息，在药物研发中是一个十分有用的工具，被称为“pharmacological MRI”。然而，fMRI在小动物实验上存在一些限制，一个是fMRI空间分辨率不够高，另一个是检测时一般需要对动物进行麻醉，而麻醉对动物大脑功能本身就具有很大的影响，在这种情况下很难得到真正具有生理意义的结果。fUS（functional ultrasound）是一种全新的脑功能成像技术，具有比fMRI更高的空间分辨率和信噪比，另外突破性的超小探头适合于自由活动动物的检测。因此，相比fMRI更加适合实验动物的脑功能检测，已经有很多研究利用fUS技术来检测动物行为或刺激相关的脑活动，取得了相当不错的效果。那么，是否也可以将其应用到药理学相关的研究中呢，下面就通过最近发表的几篇论文，给大家介绍一下fUS在药物研究中的应用吧。
01，清醒小鼠上检测ScoP对大脑灌注和功能性连接的影响
DOI: 10.1016/j.neuroimage.2020.117231
Scopolamine (ScoP)是一种精神活性物质，可影响胆碱能突触传递，从而影响大脑的功能。本文利用fUS技术首次在自由活动的小鼠上检测了ScoP对大脑各区域功能性连接的影响。
图1. fUS探头，固定装置，在清醒活动动物上进行脑功能记录的情形。
为了记录自由活动小鼠的脑功能信号，将一个支架固定在小鼠颅骨上，记录时无需开颅，动物在一个底部带滑珠的盒内活动。为避免动物运动对脑信号的影响，实验中选取了动物自发静止的时间段来进行后续的信号分析。
图2. 注射ScoP前后功能性连接在注射后一小时内的变化。第一第二行分别选取了海马和皮层的一个点，分析这一点与其它区域的功能性连接强弱。第三行，选取了10个脑区分析它们之间的功能性连接。
清醒小鼠皮下注射ScoP后，观察到海马与皮层功能性连接的增强，并且这一增强是持续性的，可维持到给药后1小时。
图3. 构建SVM线性模型来自动辨认药物作用下的功能性连接图谱。
通过机器学习的方法，根据从5只小鼠上得到的数据构建了SVM线性模型，让算法根据fUS扫描得到的功能性连接图谱自动判断是给药前还是给药后。用8只小鼠进行验证，结果发现这一SVM线性模型的辨别效果非常好(p=0.0004)。
图4. 用不同浓度的ScoP和抑制剂来验证SVM线性模型的自动检测准确度
后续采用不同浓度的ScoP和一种可以抵消其作用的抑制剂milameline来进一步验证通过机器学习得到的SVM线性模型的准确性。结果发现，SVM模型可以有效分辨出高浓度(0.5mg/kg及3mg/kg) ScoP的作用，并且这种区分可被抑制剂抵消。
以上这些结果都说明，采用fUS脑功能成像技术，仅需要很少的动物数量（5只），就可以得到足够的数据来建立有效的模型，自动辨认给药前后的功能连接图谱，并可被抑制剂抵消。这提示fUS检测到的这种功能性连接的变化可能成为一个对相关药物十分敏感的biomarker，在未来的药物研究和开发中具有应用价值。
这项研究的另一个重要特色是在清醒的小鼠上完成了全部的脑功能的检测。检测的结果与已有的小鼠fMRI检测结果并不一致，但与人体的一些实验结果一致，这很可能是由于小鼠fMRI的检测是在麻醉状态下进行的，而人体实验是在清醒状态下的。能够在清醒状态下进行脑功能检测是fUS技术在药理学研究中的一个重要优势，得到的结果更加接近生理状态，并且和人体研究的结果具有更好的可比性。
02，利用pharmaco-fUS研究药物atomoxetine（ATX）对中枢神经系统的影响
DOI: 10.1016/j.neuropharm.2020.108273
ATX是一种去甲肾上腺素重摄取抑制剂，临床上被用来治疗注意力缺陷多动障碍（ADHD）。这项研究利用fUS技术在麻醉大鼠上检测腹腔注射不同浓度的ATX对大脑各区域脑血容量（CBV）的影响。
图5. 基于脑区的分析显示不同浓度ATX对各脑区CBV的影响。
1、基于脑区的分析
腹腔注射ATX在大脑的各个区域都引起了广泛的CBV增加，尤其是在视皮层和丘脑，此外，外侧膝状体在给药后也出现一个快速的CBV增加，并且这是唯一一个反应强度与给药浓度正相关的脑区。
图6. 不同浓度ATX对各脑区功能性连接的影响。
对感兴趣脑区的功能性连接分析发现，高浓度的ATX（1mg/kg and 3mg/kg）并不影响各脑区间的功能性连接。相反，低浓度的ATX（0.3mg/kg）整体性地降低了各脑区间的功能性连接，尤其是对于亚后皮质，视皮层，海马，外侧膝状体以及中脑之间的功能性连接，抑制作用最为显著。
2、基于像素的分析
图7. 基于像素的分析，a ，b显示了采用两种图像处理方法得到的不同浓度ATX注射前后脑功能差异图。
用不同的方法进行基于像素的分析，第一种方法是将原始图像经过高斯平滑处理后直接进行分析，给药后5分钟与给药前5分钟的基线对比后得到差异图。这一分析的结果和基于脑区的分析结果类似。第二种方法对原始数据做了去除噪音和去除无关成分的处理，类似于pharmacoMRI的图像处理方法，同样得到给药前后的差异图，可以看到去除噪音和无关成分后，三种浓度ATX对CBV影响的差别更为显著，中等浓度的ATX对CBV影响要明显强于低浓度和高浓度。
从实验的结果可以看到，fUS检测到的ATX的作用与已有的fMRI，电生理等的研究结果一致。同时也证明fUS信号对比fMRI的BOLD信号具有更高的灵敏度，比如在相似的一项fMRI研究中，在丘脑检测到的信号变化大约为1.5-2%，而相同的情况下，fUS信号的变化在7%-12%。由于这种高灵敏度，这项研究提供了关于ATX影响皮层功能的一些新的信息，可能可以解释ATX在临床上的治疗作用。
fUS是一项革命性的技术，目前已发表的这两项可行性研究显示出这一技术在药物研究上的巨大优势。
一是第一次实现了在自由活动动物上检测脑功能，更好地保持了动物的正常生理状态；
二是相比fMRI具有更高的灵敏度，能够提供一系列全新的biomarker，期待未来这一技术能在药物研究领域带来更多有价值的发现。
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