本发明涉及一种检测天然原酿酱油中味精的方法，属于稳定同位素技术应用领域。
背景技术：
酱油作为中国传统的调味品，不仅能够增加和改善菜肴的口味，增添菜肴的色泽，增加人们的食欲，而且富含硒等矿物质以及多种维生素，可降低人体胆固醇，降低心血管疾病的发病率，有很好的防癌效果。随着食品工业的迅速发展，调味品市场出现了空前的繁荣和兴旺，中国酱油年产量在2011年约为500万吨，数据显示，2018年上半年全国酱油产量已超过289万吨。
天然原酿酱油是以大豆、小麦、淀粉为主要原料发酵酿制而成的具有特殊香气、色泽红褐色、滋味鲜美的调味品，不允许加入味精等含谷氨酸钠的添加剂成分。然而，传统技艺酿制酱油，三年至五年方可酿成，工序复杂且不得有差错。蒸闷大豆、摊凉豆料、制曲、高盐稀固发酵、自然晒露等，每个环节少不了精心管护。这造就了天然原酿酱油的高投入、低产量，天然原酿酱油自然无法满足国人的日常需求。2000年，我国标准sb10336规定可以以天然原酿酱油为主体，辅以植物蛋白水解液和食品添加剂配制成液体调味品。而随着我国国民经济水平的不断增长，消费者健康诉求不断增强，也推动着酱油行业消费升级，对家庭用酱油的需求由低档向高档产品过渡，而天然原酿酱油、无添加酱油等高附加值产品越来越受消费者青睐。虽然我国国家标准gb2717-2018重新定义了酱油，但是，如何确保市场上天然原酿酱油的真实性是监管机构面临的的一大技术难题。
味精，即谷氨酸钠，是谷氨酸棒状杆菌以淀粉和氮源为原料的代谢产物，具有很好的提味增鲜作用，在我国国家标准gb2760中被作为食品添加剂可应用于多种食品，也是配制酱油中氨基酸态氮的主要来源。然而，由于天然原酿酱油中天然存在谷氨酸成分，根据谷氨酸含量难以说明其来自于外源添加味精还是酱油中天然存在，因此难以辨别此类“天然原酿酱油”和“无添加酱油”的真伪。
稳定同位素受自然分馏作用的影响，不同来源的化合物会存在同位素组成特征差异。天然原酿酱油和味精来自于不同的生产原料，容易保留各自原料的同位素特征，因此利用稳定同位素比值质谱分析谷氨酸的稳定碳同位素比值的差异可检测天然原酿酱油中是否含有外源添加的味精。
技术实现要素：
发明所要解决的课题
针对酱油中添加味精而无法检测的问题，本发明的目的在于建立一种可以证实谷氨酸来源的方法，为天然原酿酱油的真实性提供技术方法。
简言之，本发明基于稳定同位素分馏理论，根据不同来源化合物存在稳定同位素组成差异的特征，采用液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(lc-irms)测定味精、酱油和大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值，建立天然原酿酱油中添加味精后稳定同位素变化模型，对比待测酱油样品的稳定碳同位素组成特征进而判断样品中是否添加味精，从而实现检测酱油中是否添加味精的目的。
用于解决课题的手段
本发明分别建立味精、大豆和天然原酿酱油中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素组成特征数据库，根据模拟实验中天然原酿酱油中添加味精后谷氨酸(钠)定碳同位素组成变化规律判断待检酱油中是否添加味精。优选地，其中所述稳定碳同位素组成特征的测定采用液相色谱-稳定同位素比值质谱仪。
具体而言，本发明的检测天然原酿酱油中添加味精的方法，包括以下步骤：
1)测定味精中谷氨酸的稳定碳同位素比值；
2)测定真实天然原酿酱油和大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值，并建立真实天然原酿酱油和大豆数据库；
3)向真实传统酱油中加入味精研究稳定碳同位素比值的变化规律，建立应用碳同位素技术检测酱油中是否含有外源添加味精的数学模型；
4)测定酱油样品中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值，并将其与真实天然原酿酱油和大豆数据库中谷氨酸钠的稳定碳同位素比值进行比较，若酱油样品中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值超出大豆数据库的最大值，则可认定酱油中含有外源添加的味精。
在一个优选实施方式中，测定味精、酱油和大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值的方法是将样品进行除杂、酸化处理以将谷氨酸钠转化成谷氨酸后，用稳定同位素比值质谱进行测定的。
在一个优选实施方式中，所述的大豆数据库涵盖用于酱油生产的、世界各地的大豆样品。
在一个优选实施方式中，在进行所述稳定同位素比值质谱测定之前进行前处理，所述前处理方式包括应用制备液相并配套元素分析-稳定同位素比值质谱仪或离线氧化还原系统及双路进样-稳定同位素比值质谱仪，或在线液相色谱-稳定同位素比值质谱系统，优选在线液相色谱-稳定同位素比值质谱系统。
在一个优选实施方式中，测定大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值时，大豆经高温酸解。
在一个优选实施方式中，在用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定前将样品用硫酸溶液进行稀释，同时将谷氨酸钠酸化成谷氨酸，加入乙酸锌和亚铁氰化钾溶液，高速离心除去不溶性蛋白质和脂质，经水系滤膜过滤后用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定谷氨酸的稳定碳同位素比值。
在一个优选实施方式中，所述硫酸溶液为ph＝3的硫酸溶液，所述水系滤膜的孔径为0.45μm或0.22μm，优选0.22μm。
在一个优选实施方式中，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱的保护气为氦气；色谱柱为耐纯水的液相色谱柱；柱流速为0.25～0.60ml/min，优选0.25ml/min；柱温为20～70℃，优选为25～30℃；流动相为ph2～7的酸性流动相；进样体积为20μl。
在一个优选实施方式中，所述液相色谱-稳定同位素比值质谱配备有isolink氧化接口，所述isolink氧化接口使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂。
在一个优选实施方式中，磷酸和过二硫酸钠溶液的浓度和流速使得m/z＝32的离子流信号强度为4000～18000mv，优选为8000mv。
本发明的有益结果
本发明采用液相色谱-稳定同位素比值质谱技术实现了味精、酱油和大豆中谷氨酸(钠)乙酸δ13c值的高精度分析与测定，根据稳定碳同位素分馏原理实现了酱油中外源添加味精的检测，为天然原酿酱油的真实性鉴别提供了一种新方法。本发明方法具有计算方便、原理科学、测定准确的特点，可促进稳定同位素技术在我国传统食品掺伪检测中的应用，为我国食品质量安全与产品真实性保障提供技术支撑。
附图说明：
图1显示lc-irms测定味精中谷氨酸δ13c的离子流图；
图2显示lc-irms测定大豆中谷氨酸(钠)δ13c的离子流图；
图3显示lc-irms测定酱油中谷氨酸(钠)δ13c的离子流图。
具体实施方式
以下更详细地描述本发明的具体实施方式。
本发明公开了一种应用稳定碳同位素技术检测天然原酿酱油中是否添加含有味精的方法，属于稳定同位素技术应用领域。
该方法包括如下步骤：
1)测定味精中谷氨酸钠的稳定碳同位素比值特征；
2)测定传统酱油及其原料大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值特征并建立数据库；
3)向真实传统酱油中模拟添加味精研究稳定碳同位素比值的变化规律，建立应用碳同位素技术检测酱油中是否含有外源添加味精的数学模型，
4)测定酱油样品的谷氨酸(钠)稳定同位素比值；将样品的数据与真实天然原酿酱油和大豆数据库数据库进行比较，若样品的数据大于数据库中的最大值时可认定酱油样品中含有味精。
需要指出的是，步骤1)和2)可以依次或同时进行，也可以先进行步骤2)然后进行步骤1)。
谷氨酸(钠)是指谷氨酸和谷氨酸钠。大豆中本来只有谷氨酸形成的蛋白质，生产酱油时加入食盐，酶解成谷氨酸时由于氯化钠的缘故会形成谷氨酸钠，因此认为酱油中同时含有谷氨酸和谷氨酸钠。因此在步骤4)中测定的谷氨酸和谷氨酸钠的总和。而味精中只有谷氨酸钠，因此在步骤1)中测定谷氨酸钠即可。
上述真实天然原酿酱油和大豆数据库应该涵盖用于酱油生产的、世界各地的大豆样品。
作为测定味精、酱油和大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值的方法，使用稳定同位素比值质谱进行测定。在进行测定之前，需要将味精、酱油和大豆样品进行除杂，并进行酸化处理以将谷氨酸钠转化成谷氨酸。酸化可以使用硫酸，例如ph＝3的硫酸溶液来进行。这是因为流动相是硫酸溶液，如果使用其它酸进行酸解时，可能会造成基线不稳将谷氨酸钠转化成谷氨酸。
另外，在将样品上样至稳定同位素比值质谱测定之前必须进行前处理。由于酱油是多种有机物的混合物，测定谷氨酸(钠)的碳同位素比值，需排除其他有机物的干扰。前处理的目的是为了将谷氨酸与其他物质分开，然后将谷氨酸转化成二氧化碳，然后再用稳定同位素比值质谱测定。前处理包括应用制备液相并配套元素分析-稳定同位素比值质谱仪或离线氧化还原系统及双路进样-稳定同位素比值质谱仪，或在线液相色谱-稳定同位素比值质谱系统，优选在线液相色谱-稳定同位素比值质谱系统。另外，测定大豆中谷氨酸(钠)的稳定碳同位素比值时，大豆经高温酸解。这是因为大豆中不含游离的谷氨酸，而是以蛋白质的形式存在。高温酸解是为了将蛋白质的肽链打开，使结合态的谷氨酸变成游离态。高温酸解的条件例如为在5％硫酸环境下，80℃酸解8h。
在用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定前将样品用硫酸溶液进行稀释，同时将谷氨酸钠酸化成谷氨酸，加入乙酸锌和亚铁氰化钾溶液，高速离心除去不溶性蛋白质和脂质，经水系滤膜过滤后用液相色谱-稳定同位素比值质谱测定谷氨酸的稳定碳同位素比值。需要指出的是，大豆酸解液和酱油中含有少量的蛋白，乙酸锌和亚铁氰化钾的作用是为了除去可溶性蛋白；而味精中只有谷氨酸钠，因此不需要这一步。
具体而言，首先，对样品进行稀释和过滤程序。样品稀释时所用的溶剂为硫酸溶液，优选ph＝3的硫酸溶液。通过稀释步骤将样品稀释至谷氨酸浓度0.1～1.2g/l，稀释后经滤膜过滤(优选水系滤膜，孔径优选0.45μm或0.22μm，更优选0.22μm)。样品稀释的目的是将样品中的谷氨酸钠有机物的含量降至合适范围，以供上样进行液相色谱-稳定同位素比值质谱测定。过滤的目的是因为液相色谱分析时要排除水不溶性杂质，防止大分子物质堵塞液相色谱柱。
对于，所采用的液相色谱-稳定同位素比值质谱仪，保护气为氦气；色谱柱为耐纯水的液相色谱柱；柱流速为0.25～0.60ml/min，优选0.25ml/min；柱温为20～70℃，优选为25～30℃；流动相为ph2～7的酸性流动相；进样体积为20μl。
液相色谱分离得到的谷氨酸需经过氧化才能生成仪器检测的二氧化碳，因此液相色谱-稳定同位素比值质谱配备有isolink氧化接口，所述isolink氧化接口使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，其中过二硫酸钠为氧化剂，磷酸为酸化剂。过二硫酸钠的浓度过高容易堵塞毛细管路系统，浓度过低则氧化能力不足。此外，氧化剂与酸化剂的流速大小也会影响氧化能力。经过研究，发现优选将调整反应助剂的浓度和流速至m/z＝32的离子流信号强度为4000～18000mv，优选至8000mv。在这种情况下，氧化能力符合仪器的分析要求。
任选地，确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定co2中δ13c的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值。
实施例
下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。
实施例一：
1.1仪器
液相色谱-稳定同位素比值质谱仪(lc-irms，配备氧化接口isolink)，上述仪器均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；采用离子型色谱柱。
1.2材料与试剂
碳同位素参考物质：蔗糖(iaea-ch-6，δ13cpdb＝-10.45‰)；超纯水(milli-q系统制备)；
正磷酸(纯度≥99％)与过二硫酸钠(纯度≥99％)；氦气(纯度≥99.999％)；0.22μm滤膜(水系)；硫酸(纯度≥99％)；味精。
1.3氧化接口工作条件
氧化接口(isolink)使用磷酸和过二硫酸钠溶液为反应助剂，用irms同时监测m/z＝32、33和34的离子流信号强度，调整磷酸和过儿硫酸钠溶液的浓度和流速确保m/z＝32的离子流信号强度为8000mv。
1.4参考物质准备
用超纯水和碳同位素参考物质(iaea-ch-6)配制0.3g/l的蔗糖水溶液，保存待用。
1.5谷氨酸工作标准物质准备
取一高纯度味精样品，用ph＝3的硫酸溶液配制成0.3g/l的谷氨酸溶液，分别进样测定参考物质iaea-ch-6和谷氨酸溶液的δ13c测定值，并根据蔗糖δ13c的测定值与真实值(-10.45‰)的差异计算得出谷氨酸工作标准物质的δ13c值。
1.6样品前处理
将味精、大豆和酱油中的谷氨酸钠转化成谷氨酸，并配制成0.3g/l的谷氨酸溶液，经0.22μm滤膜过滤后保存待用。
1.7样品测定
用液相色谱-稳定同位素比值质谱仪分别测定谷氨酸工作标准物质和味精、大豆、酱油中谷氨酸的δ13c测定值，并根据谷氨酸工作标准物质δ13c的测定值与真实值的差异计算得出样品中谷氨酸的δ13c值。其中，保护气为氦气；柱流速为0.3ml/min，柱温50℃，酸性流动相为0.2％硫酸，进样体积为20μl。。
1.8结果分析
收集国内不同品牌的味精12个，测定其谷氨酸δ13c值，结果表明味精中谷氨酸的δ13c值在-13‰～-9‰范围内波动。
收集不同产地的大豆样品38个，高温酸解后测定谷氨酸δ13c值，结果表明大豆中谷氨酸的δ13c值在-30‰～-24‰范围内波动。
收集不同品牌的天然原酿酱油14个，测定结果表明天然原酿酱油的谷氨酸δ13c值在-24‰～-28‰范围内波动，与大豆样品的波动范围相符。分析其原因，在于天然原酿酱油中的谷氨酸(钠)来自于大豆蛋白质酶解，酱油生产过程谷氨酸碳同位素组成特征不发生变化，因而天然原酿酱油保留了大豆原料的碳同位素特征。
取一天然原酿酱油样品，根据其谷氨酸含量加入不同比例的味精，结果如表1所示。
表1酱油中加入不同比例味精后谷氨酸δ13c值(‰)
表1数据显示，由于大豆和味精中的谷氨酸具有明显不同的δ13c值，当酱油中添加味精后谷氨酸δ13c值会随着添加量的增大而偏正，而且线性拟合关系表明这种变化趋势为显著正相关(r2＝0.98)。
由此我们可知，根据不同来源的谷氨酸中稳定碳同位素组成特征差异检测酱油中是否添加味精是可行的，而构建大豆和真实天然原酿酱油的谷氨酸δ13c数据库有助于避免对待检样品产生假阳性误判。
在此技术背景下，调查四个品牌的10个市售酱油产品，结果见表2。
表2市售酱油的谷氨酸δ13c值(‰)
从表2数据可知，上述市售酱油的谷氨酸δ13c值在-25.00‰～-11.37‰之间，除1#、7#和8#样品外，其余7个样品均标注有添加谷氨酸钠(即味精)，样品的谷氨酸δ13c值在-19.39‰～-11.37‰之间，符合非天然原酿酱油的特征。7#样品虽然标注未添加味精，但其谷氨酸δ13c值为-14.98‰，怀疑是非如实标注的产品，并且与同品牌的6#样品相比，谷氨酸δ13c值差异只有2.33‰，因此可断定该样品不是天然原酿酱油。同样，根据8#样品的同位素特征，也不符合本发明初步建立的天然原酿酱油的碳同位素数据库特征，不是真正的天然原酿酱油，而对比同品牌高中低档产品，呈现出谷氨酸δ13c逐渐偏正的趋势，这是越是低档产品中添加味精量越大的缘故。品牌1的1#～3#样品也呈现出谷氨酸δ13c值随价位高低而变化的特点，但1#的谷氨酸δ13c值为-25.00‰，可以判断为是天然原酿酱油。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。